Biệt Đội Siêu Anh Hùng mở đầu bằng chuyện Loki, người em trai nuôi độc ác của Thor đến từ hành tinh Asgard xa xôi, đột nhập vào căn cứ của S.H.I.E.L.D để chiếm khối Tesseract chứa nguồn năng lượng vô hạn. Hắn còn âm mưu dẫn một đội quân tới Trái đất thôn tính và biến loài người thành nô lệ. Nick Fury, giám đốc của S.H.I.E.L.D nỗ lực tập hợp một đội quân tinh nhuệ nhất để bảo vệ trái đất khỏi âm mưu của Loki. Tuy nhiên, anh và người cộng sự lâu năm là điệp viên Coulson phải tìm cách thuyết phục các siêu anh hùng phối hợp thành một đội thay vì chống lại nhau...